年国际卒中大会(ISC)在3月17日-19日顺利召开。会议由美国心脏协会(AHA)/美国卒中协会(ASA)主办，是世界上规模最大的脑血管疾病科会和治疗会议。本届国际卒中大会上本文作者LudmilaBelayev以On-Demand形式作题为ConcertedNeuroprotectionbyaPAF-ReceptorAntagonistPlusanInflammatoryResponseModulatorinExperimentalIschemicStroke的报告。该报告正是来自于作者在年12月最新发表在季刊BrainCirculation的文章。文章首次证实了PAF受体拮抗剂联合类二十二烷酸可以减轻缺血性卒中后的脑损伤，促进神经功能的恢复。下面我们来具体看看这篇文章吧！
LudmilaBelayev原名：Blockingpro?inflammatoryplatelet?activatingfactorreceptorsandactivatingcellsurvivalpathways:Anoveltherapeuticstrategyinexperimentalischemicstroke译名：阻断促炎性血小板活化因子受体并激活细胞存活通路:实验性的缺血性脑卒中的治疗新策略期刊：BrainCirculation
发表时间：.12第一作者：LudmilaBelayev通讯作者：NicolasG.Bazan通信作者单位：NeuroscienceCenterofExcellence,SchoolofMedicine,LouisianaStateUniversityHealthNewOrleans,GravierStreet,SuiteD,NewOrleans,LA,,USA缺血性脑卒中是排名前列的死亡因素，还是造成残疾的主要原因。目前现有的治疗选择十分有限，而且对发生在大脑缺血位点的免疫反应和急性炎症没有作用。缺血再灌注损伤与多种神经炎性通路的失调和神经元回路的破坏有关，这继而影响脑卒中幸存者的诸多病理。我们将介绍一种针对病理学靶点以及解决神经炎性损伤的新方法，以维持神经网络的完整性和神经的恢复。为了解决脑卒中的多致病因素，我们计划进行一项联合疗法，阻断促炎症反应，同时促进神经保护和消炎。使用LAU-这一小分子血小板活化因子受体（PAF-R）拮抗剂可以强力抑制促炎信号通路。血小板活化因子（PAF）通过增加钙离子内流、破坏血脑屏障、降低大脑血流量以及激活白细胞来损伤大脑。过度激活的免疫细胞PAF释放触发了神经损伤，那么抑制这一过程就对神经存活和避免缺血性脑损伤至关重要。LAU-是一种强效的特异性PAF-R拮抗剂，这在大鼠和小鼠的大脑缺血性损伤模型上都已得到验证。在中脑动脉闭塞2h后用LAU-可以改善大鼠行为，减小梗死体积。而且LAU-具有持续的神经保护作用，使实验动物在卒中后仍存活数周。已知具有生物活性的类二十二烷酸（docosanoids）——DHA衍生的内源性脂质介质——有神经保护作用和促进消炎作用。我们团队前期对人工合成的类二十二烷酸NPD1和阿司匹林触发的NPD1（AT-NPD1）已有研究。我们发现NPD1具有抗炎活性，能促进神经细胞的存活。NPD1和AT-NPD1的生物活性得益于免疫系统、炎症、细胞存活以及细胞互作相关的信号通路的特异活性或调控。越来越多证据显示消炎并不是一个被动的过程，而是一个由大量的调控因子统筹进行的相互作用，抑制炎症反应。这一过程主要步骤包括清除死亡细胞、营造抗炎症的内环境，产生促活因子滋养组织的重建和修复。LAU-与DHA结合调控了类花生酸通路和脂质介质，这也是通过大脑中的抗炎和神经保护作用激活了细胞的存活通路。因此本研究中借助多模式磁共振成像、神经行为学试验和脂质组学分析的方法，利用构建大鼠缺血模型研究LAU-与特异性的类二十二烷酸（DHA,NPD1和AT-NPD1）联用的治疗效果。在此之前还没有研究用这种组合方式治疗缺血性脑卒中。1.动物本研究所有试验均通过了动物关爱机构和路易斯安那州立大学健康科学中心使用委员会的审批。所有试验使用的雄性SD大鼠（-g）由查尔斯河实验室提供。2.体内缺血模型：短暂性大脑中动脉闭塞(MCAo)用管腔内微导管栓塞法对大鼠执行2h右侧MCAo。使大鼠从麻醉中苏醒，并在MCAo进行到60分钟时行标准神经行为测试，以确定神经功能缺损的状况。2h的MCAo后再次麻醉。重新插入体温探针，小心移除管腔内缝线，根据实验设计在1、3、7、14天处死实验鼠，不控制食物和水的量。3.试验流程大鼠被随机分为LAU-组（30或60mg/kg，卒中后2h）、NPD1组（μg/kg）、AT-NPD1组（μg/kg）、DHA组（5mg/kg）、对照组（0.9%生理盐水）。NPD1组、AT-NPD1组和DHA组在MCAo后3h进行静脉滴注。我们进行了三项系列试验。系列1，研究LAU-+NPD1的作用：单用LAU-（30mg/kg）和NPD1，以及联用。在第1、2、3、7、14天评估行为，接着在第14天行核磁共振检查。系列2，研究LAU-+AT-NPD1的作用：单用LAU-（60mg/kg）和AT-NPD1，以及联用。在第1、2、3天评估行为，接着在第3天行核磁共振检查。系列3：研究LAU-+DHA的作用：单用LAU-（60mg/kg）和DHA，以及联用。在第4h和第1天评估行为，接着在第1天进行脂质组学分析。4.行为学评估我们主要通过综合神经评分来评估行为（0-12分，0=正常，12=最严重）。量表由两项测试组成，多角度评估神经功能：（1）姿势反射测试；（2）前肢放置测试。未取得高等级评分（10-11分）的大鼠将排除出后续试验。5.大脑取样和脂质组学分析在第一天处死大鼠以研究LAU-+DHA不同脂质介质在缺血核心区和半暗带的表达。将大脑移除，分为左脑和右脑，将半暗区和核心区在前囟水平上分离用于脂质组学分析。我们提取了以下脂质：前列腺素（PGE2，PGF2-α，6-酮-PGF1-α，PGD2）、羟基十八碳二烯酸（HODE）、11-脱氢血氧烷B2、血栓素B2（TXB2）、羟二十烷四烯酸（12-HETE）。1.生理变化和死亡率直肠和颞肌温度、动脉血气、血浆葡萄糖等指标显示各组之间无显著差异。各组在用药后均未观察到不良行为副反应。研究过程中无动物死亡。2.LAU-+NPD1改善了行为功能，减轻了MCAo14天后的大脑缺血性损伤我们研究了单用LAU-和NPD1是否和联用一样影响大脑缺血14天后的行为和梗死面积。试验设计如图1a所示。单用LAU-和NPD1治疗相较于对照组在第1天分别改善了16%和37%的行为分，持续到第14天行为评分的改善为26%和40%（图1b）。使用LAU-+NPD1方案增强了神经保护的作用，在第14天行为评分提升了54%（图1b）。LAU-+NPD1组与单用LAU-组之间的行为评分具有显著差异，而在LAU-+NPD1组与NPD1组之间不具显著差异。联合治疗和单用NPD1治疗随时间显著改善对侧前肢的视觉旁路、背侧和旁侧触觉反应（图1c-e）。图1.LAU-+NPD1组卒中后14天行为。（a）试验设计。（b）神经总评分（正常=0，最高=12）和随时间的前肢反应的康复情况。P＜0.05，*对照组vs所有治疗组；n=5-6/组
缺血的核心区和半暗区和全损伤体积用第14天的T2图谱进行计算（图2）。对照组大鼠T2WI显示在缺血核心区和半暗区观察到大片损伤和T2白质高信号，且都伴有水肿。所有的治疗组，特别是NPD1组和LAU-+NPD1组只在皮质和皮质下一小部分区域观察到损伤。NPD1组和LAU-+NPD1组的3D损伤体积较对照组都有显著的减小（图2b）。所有治疗组较对照组的全区域、核心区和半暗区T2WI损伤体积都有显著的减小（图2c）。联合疗法在减少缺血核心区的损伤上较单用LAU-疗法有显著性的差异（图2c）。图2.LAU-+NPD1组减小了卒中的损伤体积。（a）T2WI的核心区和半暗区。（b）在第14天T2图谱计算3D损伤体积，自动识别核心区（红）和半暗区（蓝）组织。（c）缺血核心区、半暗区和全区损伤体积。P＜0.05，*对照组vs所有治疗组；**LAU-vsLAU-+NPD1，n=5-6/组
3.LAU-+AT-NPD1在MCAo之后3天表现出优良的神经保护作用试验设计如图3a所示。单用LAU-和AT-NPD1治疗在第1天就提升了神经功能的评分，持续到第3天评分相较于对照组提升了33%和27%（图3b）。LAU-+AT-NPD1联用在第3天行为评分提升了54%（图3b）。所有治疗组都减小了全损伤的体积（图3c）。联合治疗组相较于单用LAU-组，减小了全损伤的体积（图3c）。T2WI、伪彩色图像和3D体积都显示所有治疗组都减少了缺血核心区和半暗区的损伤（图3d-f）。联合治疗组显著减少了大脑的损伤，并且主要控制在了皮质下区域。图3.LAU-+AT-NPD1在卒中后3天具有保护性。（a）试验设计。（b）神经总评分（正常=0，最高=12）。（c）T2图谱计算的全区、核心区、半暗区损伤体积。（d）T2WI图像。（e）伪彩色T2图像。（f）T2WI叠加的3D损伤体积。P＜0.05，*对照组vs所有治疗组；LAU-+AT-NPD1vsAT-NPD1，vsLAU-，n=5-7/组
4.LAU-+DHA调节大脑血流和炎症信号，使神经在MCAo后第1天就得到恢复我们研究了缺血性卒中后1天单用LAU-和DHA以及二者联用治疗的行为和不同脂质介质的表达量。试验设计如图4a所示。单用LAU-和DHA使行为评分较对照组提升了30%~35%（图4b）。LAU-+DHA联用组的神经保护作用在第1天增强了47%。提取自同侧的缺血核心区和半暗区的前列腺素、HODE和12-HETE的表达如图4c-h所示。上调最多的来自单用LAU-和LAU-+DHA联用组的半暗区。单用LAU-组的前列腺素中，PGE2增加了18倍，PGF2-α增加了47倍，6-酮-PGF1-α增加了10倍，PGD2增加了25倍。LAU-+DHA联用组PGE2增加了6倍，PGF2-α增加了13倍，6-酮-PGF1-α增加了6倍，PGD2增加了14倍（图4c-f）。HODE表达量在LAU-组增加了5倍，在LAU-+DHA组增加了4倍（图4g）。12-HETE的表达量在DHA组，LAU-组，LAU-+DHA组分别减少了83%、67%和72%（图4h）。图4.LAU-+DHA在卒中后1天改善了行为，调节了炎症反应。（a）试验设计。（b）神经总评分。（c-h）MCAo后从核心区和半暗区提取的脂质定量分析。P＜0.05，*对照组（半暗区）vs所有治疗组；**对照组（核心区）vs所有治疗组，n=3-4/组
本研究中我们测定了大鼠MCAo后用一种PAF-R拮抗剂—LAU-与NPD1，AT-NPD1和DHA结合的治疗效果。我们首次展示了LAU-与各种类二十二烷酸结合在缺血性卒中之后减轻缺血性的脑损伤，促进神经功能的恢复，重塑脂质介质通路的稳态。结果证明了LAU-联合NPD1和AT-NPD1相较于单用LAU-可以显著减少梗死面积，提升神经功能评分。这说明联合治疗的方案对缺血性卒中有优秀的治疗效果。PAF可以用于抑制PAF的促炎反应通路，PAF的积累会导致包括大脑缺血再灌注的神经细胞损伤。当发生缺血损伤时，PAF含量升高，成为促炎反应的信使，也是促使神经损伤的神经毒性的介质。我们前期已经证实LAU-用于试验性的缺血性卒中时具有强烈的神经保护作用，减少大脑梗死体积，提升神经功能评分。NPD1是DHA衍生的脂质介质，在发生氧化应激时能促进细胞的存活。试验性的缺血性卒中里使用的DHA具有脂质氧合作用生成了NPD1，然后中和了促炎反应的生物活性并保持其神经保护作用。NPD1的保护性包括减少梗死体积，提升神经功能评分，以及减少多形核白细胞渗透，通过激活环氧酶2和细胞核因子κB抑制缺血性损伤。AT-NPD1是一种新发现的内源性DHA衍生脂质介质，由阿司匹林乙酰化COX-2生成。当在卒中发生后3h给予AT-NPD1，其产生了持续性的神经行为的恢复，减轻了大脑的梗死和水肿，改善组织基质，保护了脑白质。LAU-不论是联合NPD1还是AT-NPD1治疗，相较于其他的单用药组都更好地促进了神经的恢复，说明它们的协同神经保护作用具有疗效。联用LAU-+DHA和单用LAU-都增加了前列腺素的表达。前列腺素是具有生物活性的脂质，由花生四烯酸代谢而来。其维持了自身稳态的功能还调控致病的机制，如炎症反应。这些代谢产物表达量的增加表明组织卒中后还维持着调节大脑血流和炎症反应过程的能力。大脑缺血引发的瀑布级联反应激发细胞膜上游离脂肪酸的释放，特别是花生四烯酸和DHA。这些生物活性的脂质信使反过来升高了多种下游的其他脂质分子，如PAF和类花生酸（前列腺素和白细胞三烯）。这些分子对卒中后的脑组织具有神经保护性。因此它们在很大程度上促进了卒中的恢复和康复。PGE2，PGF2-α，6-酮-PGF1-α，PGD2都显示出了作用于血管的生物活性，还能改善卒中后的结局。PGE2通过与4种膜受体，即EP1、EP2、EP3、EP4结合可以发挥多种生理功能。敲除EP2受体基因会显著增加小鼠缺血性卒中的脑损伤体积，而且激活该受体可以抵抗MCAo带来的兴奋性毒性和缺氧损伤。6-酮-PGF1-α是环前列腺素的代谢产物，在MCAo后与前列腺素I2受体结合减少大脑缺血性损伤，促进缺血性卒中后长期的神经功能恢复。PGD2是大脑中含量最多的前列腺素，是神经炎症反应的调节子。PGD2具有DP1的受体活性，激活后对卒中的结局有益，使兴奋性毒性和缺血性脑损伤降至最低。研究中LAU-组和LAU-+DHA组大鼠HODE表达量升高，同时还观察到12-HETE表达量下降。HODE是亚油酸的衍生物，与神经传导和大脑损伤的炎症反应的调控有关，其可以降低谷氨酸的神经兴奋毒性。12-HETE是花生四烯酸的衍生物，由脂肪氧合酶催化合成的脂质，在缺氧环境中会上调。12-HETE是促炎的脂质介质，可以促进炎症通路和细胞死亡进而加重缺血性的损伤。有研究显示抑制12-HETE可以减少梗死体积，改善行为评分。我们的研究结果证实LAU-可以调控减少炎症和兴奋毒性致的神经损伤的代谢产物。在LAU-组和LAU-+DHA组大鼠中观察到的很可能是通过前列腺素增加大脑血流，调节灌注，同样也是降低12-HETE表达，增加HODE表达来抑制促炎信号的结果，即LAU-（PAF-R拮抗剂）的抑制PAF的活性。总而言之我们的研究结果支持了PAF抑制剂与特定的类二十二烷酸联用可以增强疗效，大脑缺血后协同保护神经的预测。这种联合疗法通过促进神经功能恢复重塑了脂质介质稳态，而且在未来治疗缺血性脑卒中具有广阔前景。BrainCirculation
年10月-12月刊
LudmilaBelayevNicolasG.BazanNationalInstituteofNeurologicalDisordersandStrokeunderawardnumbers1R01NS(N.G.B.andL.B.)and1R01NS(N.G.B.andL.B.)葫芦巴参考文献
1.BazanNG,HalabiA,ErtelM,PetasisNA.Neuroinflammation.In:BradyST,SiegelGJ,AlbersRW,PriceDL,editors.BasicNeurochemistry.8thed..,Ch.34.NewYork:AcademicPress;.p.?20.Availablefrom: